Molecular Quantification Toolkit

Photobleaching- und Photoaktivierungsversuche erfordern für die Manipulation von Organellen und Kondensaten eine genaue Bestimmung der Zellkompartimente. Mit dem ZEN Molecular Quantification Toolkit können Sie relevante Bereiche entweder manuell oder mithilfe einer automatisierten Analyse unkompliziert festlegen und sie für das Bleaching abgrenzen und kontrollieren. Dank der Lasertechnologie im konfokalen System werden diese Bereiche Pixel für Pixel mit der effizientesten Wellenlänge und Intensität anvisiert.

Versuche zu molekularen Dynamiken beinhalten komplexe Analysen, die die Einbeziehung von Referenzbereichen und -bildern oder die Anpassung exponentieller Kurven erfordern. Das Toolkit bietet eine geführte Analyse für Anwendungen zur Photomanipulation wie Diffusionskonstanten einer Kinetik erster und zweiter Ordnung bei FRAP, alle gängigen Methoden für die Effizienzberechnung bei FRET und eine flexible ratiometrische Analyse. Außerdem werden die Ergebnisse visuell äußerst ansprechend dargestellt.

Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP) dient der Untersuchung der Mobilität von fluoreszierenden Molekülen. In einem begrenzten Bereich werden Fluorophore irreversibel inaktiviert. Anhand der Rate, mit der der Austausch zwischen in der Nähe befindlichen fluoreszierenden Molekülen und diesem Bereich stattfindet, können die Diffusionsrate und die Menge an gebundenen und ungebundenen Molekülen bestimmt werden.

Basierend auf dem Standard-FRAP-Verfahren existieren verschiedene weitere Methoden. Inverse FRAP (iFRAP) und Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) zeigen, ob ein Bereich (z. B. eine Organelle) in aktivem Austausch mit ihrer Umgebung steht oder isoliert ist. Mit Fluorescence Localization After Photobleaching (FLAP) können Zielmoleküle präzise räumlich bestimmt werden. All diese Methoden werden vom Toolkit unterstützt.

Beim FRET werden die physikalischen Prinzipien des Förster-Transfers, einem Energietransfer zwischen zwei in unmittelbarer Nähe befindlichen (< 10 nm) passenden Fluorophoren, für Messungen genutzt. Auf diese Art werden kleinste Details an dynamischen Proteinassoziationen und -dissoziationen sichtbar gemacht.

Das Toolkit stellt zwei Workflows für die beiden hauptsächlich genutzten FRET-Methoden bereit – die erste ist das Akzeptor-Photobleaching. Hierbei wird ein Interessensbereich im Akzeptorkanal ausgebleicht, was zu einer Inaktivierung des Akzeptors führt und einen Förster-Energietransfer vom Donor ausschließt.