EM de volumen con FIB-SEM criogénica
Técnicas de EM de volumen

FIB-SEM criogénica

Capte una instantánea de la dinámica celular en estados casi naturales con ultrarresolución

  • Preservación casi natural y sin artefactos de muestras biológicas
  • Máxima resolución en el eje z
  • Captura de imágenes isotrópicas en 3D

EM de volumen con FIB-SEM criogénica

Con la FIB-SEM se capturan imágenes de la muestra con el SEM y, a continuación, un haz de iones focalizado fresa un máximo de 3-10 nm antes de volver a tomar imágenes secuencialmente. El diminuto tamaño del paso en Z puede calibrarse con la resolución XY del SEM para la captura de imágenes en 3D isotrópicas, lo que convierte a la FIB-SEM en una opción excelente para mediciones en 3D precisas. La fijación química tradicional de células o tejidos para microscopía electrónica puede ocasionar cambios ultraestructurales. La fijación criogénica preservará la muestra en estados casi naturales y la FIB-SEM criogénica, que mantiene la muestra a baja temperatura, captará una instantánea en 3D con ultrarresolución en estado casi natural de los acontecimientos celulares. Puede combinarse con otros métodos criogénicos, como la microscopía óptica y confocal.

Representación esquemática de un flujo de trabajo típico

Fresado de FIB-SEM criogénica

1

Con un FIB se fresa una muestra vitrificada y sin tinción hasta que la estructura en cuestión se hace visible.

Adquisición de imágenes de FIB-SEM criogénica

2

Se capturan imágenes de la superficie de la muestra recién expuesta de la estructura de interés. Este proceso de fresado y captura de imágenes se repite hasta que se ha capturado una imagen completa de la estructura. La muestra permanece vitrificada durante todo el proceso.

Segmentación de procesamiento

3

Las imágenes de microscopio electrónico adquiridas se procesan y alinean digitalmente en un conjunto de datos en 3D. Los compartimentos celulares se pueden identificar y segmentar.

Análisis de visualización en 3D

4

El conjunto segmentado de datos en 3D se puede visualizar, estudiar y analizar estadísticamente.

Ejemplo de aplicación

Comprender el proceso de biomineralización de cristales de calcita en un cocolitóforo

S. Sviben y A. Scheffel, Instituto Max Planck de Fisiología Molecular de Plantas, y L. Bertinetti, Instituto Max Planck de Coloides e Interfaces, Potsdam-Golm, Alemania

Formación de cocolitos en el cocolitóforo Emiliania Huxleyi

Visualización de partículas de calcita y su entorno ultraestructural

Es difícil capturar imágenes del entorno ultraestructural de las fases cálcicas solubles y amorfas de los cocolitóforos con los protocolos clásicos de preparación de base acuosa. En condiciones criogénicas, el FIB-SEM permite captar imágenes de algas marinas vitrificadas en estado casi natural, dilucidando la ultraestructura en 3D.

Las células de E. huxleyi se congelaron a alta presión. Durante el proceso de captura de imágenes, la muestra se mantuvo en estado de congelación; el conjunto de datos FIB-SEM se adquirió utilizando un ZEISS Crossbeam en condiciones criogénicas. La reconstrucción en 3D muestra los cocolitos maduros (amarillo), un cocolito in statu nascendi (azul) y cuerpos lipídicos (rojo).

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