Aplicaciones de FIB-SEM criogénica — Cortesía de P. Munro y H. Armer, Instituto de oftalmología UCL, Londres, Reino Unido. Courtesy of P. Munro and H. Armer, UCL - Institute of Ophthalmology, London, UK.

Resumen

SEM con caras de bloque en serie

Descubra ejemplos inspiradores

La microscopía electrónica de barrido con cara de bloque en serie (SBF-SEM) emplea un ultramicrótomo dentro de la cámara SEM para captar imágenes en 3D de la ultraestructura de una muestra biológica sumergida en resina de un área grande.

Una cuchilla de diamante corta secciones del bloque de muestra y se captan imágenes de la superficie expuesta de la muestra mediante el haz de electrones y el detector de electrones de retrodispersión. El proceso de corte y captura de imágenes se repite automáticamente hasta que se adquiere el stack deseado –o todo el stack– en la dirección z de la muestra.

Las imágenes en 2D individuales se unen y alinean para crear un volumen en 3D de la muestra.

Comprender las conexiones neuronales dentro del cerebro y la morfología de las células neuronales

El cerebro es un órgano complejo con millones de conexiones neuronales y vías de señalización. Comprender la relación entre la estructura y la función del tejido cerebral ayuda a aclarar parte de esta complejidad, con el fin de entender mejor cómo se organizan las redes neuronales y, a largo plazo, saber cómo tratar ciertas patologías a través de intervenciones médicas. SBF-SEM es la solución ideal para captar imágenes y seguir neuronas con protuberancias largas y delgadas, como las dendritas y los axones.

El vídeo muestra las secciones transversales de una muestra de cerebro de ratón captadas con SBF-SEM. La alta resolución conseguida con este enfoque puede observarse claramente en cada una de las imágenes de caras en bloque único, lo que permite identificar las distintas estructuras. Cortesía de Prof. Mark Ellisman, Universidad de California, San Diego, EE. UU.

Stack de un cerebro de ratón incluido en resina y luego capturada mediante un detector BSE y un equipo SBF.

Aquí se muestra una pila de imágenes de un cerebro de ratón sumergido en resina y visualizado mediante un detector BSE y un equipo SBF-SEM como parte de una ejecución automatizada para generar un volumen en 3D de alta resolución. Cortesía de Naomi Kamasawa, Instituto Max Planck Florida, y R. Shigemoto, Instituto Nacional de Ciencias Fisiológicas de Okazaki, Japón.

La animación muestra una serie de cortes individuales (x-y) tomados de un conjunto de datos en 3D de tejido cerebral. La reconstrucción completa del volumen en 3D permite también la visualización de planos de los que no se habían captado imágenes directas (x-z, y-z). Se captaron 75 imágenes en total con píxeles de 7 nm y una sección de 15 nm de grosor. Cortesía de Naomi Kamasawa (Instituto Max Planck Florida, Jupiter, EE. UU.), y Ryuichi Shigemoto (Instituto Nacional de Ciencias Fisiológicas de Okazaki, Japón).

Las neuronas individuales y los compartimentos celulares pueden identificarse y seguirse fácilmente a lo largo de la dimensión z.

Estudio de la red neuronal y las sinapsis de muestras neurobiológicas

Dado que la SBF-SEM permite la captura de imágenes de alta resolución en 3D, se pueden obtener imágenes de muestras como este cerebro de ratón y observar neuronas individuales y compartimentos celulares. Se capturaron imágenes de esta muestra utilizando el SBF-SEM con una pila de 75 imágenes con píxeles de 7 nm y el micrótomo ajustado para eliminar 15 nm/corte.

Cerebro de ratón (cultivo de neuronas del hipocampo que expresan PSD95-APEX2 para teñir las densidades postsinápticas)

Explorar cultivos de neuronas del hipocampo para comprender las morfologías y las redes neuronales

La captura de imágenes de alta resolución de características tales como dendritas delgadas, axones, protuberancias celulares y conexiones entre neuronas individuales es clave para la comprensión fundamental de las morfologías y redes neuronales.
Las imágenes muestran un único corte de un conjunto de datos en 3D de un cultivo de neuronas del hipocampo que expresan PSD95-APEX2 para teñir las densidades postsinápticas (flechas). La imagen se adquirió con SBF-SEM y Focal Charge Compensation. La ultraestructura, como las dendritas finas y las conexiones, son visibles con alta resolución gracias a la eliminación de los efectos de carga. Cortesía del National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), Universidad de California, San Diego, EE. UU.

Investigación sobre la mielinización de los axones para comprender la esclerosis múltiple y la enfermedad de Parkinson

La mielinización de los axones está alterada en enfermedades como la esclerosis múltiple y la enfermedad de Parkinson. Las micrografías electrónicas proporcionan información de alta resolución suficiente para contar el número de laminillas de mielina individuales y medir el grosor total de la vaina. La naturaleza dispersa de las estructuras de estas muestras implica la existencia de grandes zonas de resina pura no conductora, lo que provoca importantes efectos de carga. El uso de Focal Charge Compensation elimina dichos efectos, gracias a lo cual podrá capturar imágenes con la máxima resolución en las tres dimensiones.

Los efectos de carga pueden ocasionar problemas importantes a la hora de captar con el SEM imágenes de muestras del ámbito de ciencias de la vida, ya que reducen en gran medida la calidad de imagen. Cuando se capturan imágenes de este haz de axones de rata en modo alto vacío y sin compensación de carga focal, se aprecian claramente los efectos de carga. Por el contrario, cuando las imágenes se captan con Focal Charge Compensation, no se aprecian efectos de carga, incluso en grandes extensiones de resina pura. Las imágenes muestran un haz de axones de ~300 micrones de diámetro con diferentes aumentos (cortesía del National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), Universidad de California, San Diego, EE. UU.).

Haz de axones de rata captado en SEM en modo alto vacío con Focal Charge Compensation. Los efectos de carga se mitigan. Imagen cortesía del National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), Universidad de California San Diego, EE. UU.
Haz de axones de rata captado en SEM en modo alto vacío con Focal Charge Compensation. Los efectos de carga se mitigan. Imagen cortesía del National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), Universidad de California San Diego, EE. UU.

Haz de axones de rata captado con SEM en modo de alto vacío sin Focal Charge Compensation. Los efectos de carga se aprecian claramente. Imagen cortesía del National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), Universidad de California San Diego, EE. UU.

Haz de axones de rata captado con SEM en modo de alto vacío sin Focal Charge Compensation. Los efectos de carga se aprecian claramente. Imagen cortesía del National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), Universidad de California San Diego, EE. UU.

Haz de axones de rata captado con SEM en modo de alto vacío sin Focal Charge Compensation. Los efectos de carga se aprecian claramente. Imagen cortesía del National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), Universidad de California San Diego, EE. UU.
Haz de axones de rata captado en SEM en modo alto vacío con Focal Charge Compensation. Los efectos de carga se mitigan. Imagen cortesía del National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), Universidad de California San Diego, EE. UU.
Haz de axones de rata captado en SEM en modo alto vacío con Focal Charge Compensation. Los efectos de carga se mitigan. Imagen cortesía del National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), Universidad de California San Diego, EE. UU.
Haz de axones de rata captado en SEM en modo alto vacío con Focal Charge Compensation. Los efectos de carga se mitigan. Imagen cortesía del National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), Universidad de California San Diego, EE. UU.

La animación muestra una serie de cortes individuales (x-y) de médula espinal de rata mediante SBF y Focal Charge Compensation. Las laminillas individuales dentro de las vainas de mielina de los axones son claramente visibles, así como los microtúbulos y otros orgánulos celulares del conjunto de datos original.

Esta imagen de SBF-SEM proporciona información de alta resolución suficiente para contar el número de laminillas de mielina individuales y medir el grosor total de la vaina. Imágenes captadas con Focal Charge Compensation que no muestran efectos de carga incluso en grandes extensiones de resina pura.

Identificación de astrocitos en una muestra de cerebro

Muestra de cerebro con astrocitos marcados

La imagen de esta muestra de cerebro fue captada con SBF-SEM. Los astrocitos (turquesa) pueden identificarse, visualizarse y segmentarse fácilmente en 3D. Cortesía de P. Munro y H. Armer, Instituto de oftalmología UCL, Londres, Reino Unido.