Microscopía de lámina de luz reticular en investigaciones sobre ciencias de la vida

Durante la transición del epiblasto preimplantatorio (naïve) al estado pluripotente, más de 100 células se organizan en un embrión de ratón preimplantatorio de aproximadamente 60-80 µm de diámetro. Para examinar los cambios en la expresión génica durante esta transición, tanto las muestras vivas como las fijas se captan en diferentes puntos temporales por medio de microscopía confocal con disco giratorio. El análisis volumétrico de los patrones de expresión celular aporta evidencia sobre los mecanismos moleculares que regulan el desarrollo de los embriones de ratón preimplantatorios.

Para determinar qué células expresan marcadores celulares específicos y cómo se organizan estas células entre sí, se requiere microscopía confocal para captar imágenes volumétricas de los embriones preimplantatorios. Los embriones en esta etapa son sensibles a los cambios en el entorno de crecimiento, la integridad estructural y la fototoxicidad. Para evitar cualquier cambio anómalo en el fenotipo del desarrollo, los embriones no podían forzarse contra el cubreobjetos y era necesario captar las imágenes rápidamente y con baja fototoxicidad. La única opción disponible era utilizar microscopía confocal con disco giratorio. Este método de captura de imágenes satisfacía la necesidad de baja fototoxicidad, y casi proporcionaba la velocidad requerida, pero se veía afectado por la drástica pérdida de intensidad de la señal al aumentar la profundidad de la captura de imágenes dentro de los embriones. En consecuencia, normalmente se captaban imágenes solo hasta la mitad de la profundidad de las muestras.

El microscopio ZEISS Lattice Lightsheet 7 permitió captar imágenes de toda la profundidad de los embriones con escasa o nula fototoxicidad, a la velocidad requerida para evitar cualquier artefacto de movimiento y con una pérdida mínima de la intensidad de la señal. Además, la captura de imágenes volumétricas de los embriones mediante ZEISS Lattice Lightsheet 7 permitía una resolución casi isotrópica para lograr una representación más precisa de la organización celular dentro del embrión. Es importante destacar que esta tecnología de captura de imágenes nos permitirá medir las firmas de expresión génica durante esta etapa crucial en el desarrollo embrionario.

Volumen captado: 230 µm × 124 µm × 94 µm, 30 ms de tiempo de exposición, 30 × 1000 de lámina de luz reticular, dos canales.

La microscopía confocal convencional no puede captar imágenes de todo el modelo celular en 3D con una resolución temporal superior a la frecuencia de latidos.

La capacidad de ZEISS Lattice Lightsheet 7 para efectuar una captura rápida de las imágenes volumétricas con resolución subcelular puede utilizarse para investigar las variaciones en los tejidos, como la contractilidad y la viabilidad celulares, entre otras.

Un solo volumen cada 1,26 s, 48 vol/min durante 1 min, volumen captado: 300 µm × 435 µm × 125 µm, 2 µm de tamaño de paso, 126 planos por volumen, 1 ms de tiempo de exposición, 100 × 1800 de lámina de luz reticular.

Las células se cultivan sobre polímero de cicloolefina (COP) con una estructura en rejilla para observar cómo avanzan los conos de crecimiento por la rejilla. Los conos de crecimiento son extremadamente sensibles a la luz y empiezan a encogerse cuando se exponen a demasiada luz de excitación. Además, la estructura en rejilla sobre el COP plantea muchos inconvenientes para los sistemas tradicionales de captura de imágenes. Pueden observase artefactos de doble imagen cuando se utiliza un confocal de barrido láser tradicional. El COP también tiene un índice de refracción de 1,53, mientras que el vidrio tiene un índice de refracción de 1,52, y el grosor de la base del COP es de 200 µm; estos parámetros pueden ocasionar un desenfoque de las imágenes.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 es capaz de superar estos inconvenientes. Al orientar la estructura en rejilla para que quede paralela a la lámina de luz reticular y ajustar la óptica de forma libre específica de Lattice Lightsheet 7, se puede eliminar la doble imagen. Además, la delicadeza de ZEISS Lattice Lightsheet 7 la convierte en la herramienta perfecta para investigar el movimiento dinámico de las neuronas en desarrollo en 4D con alta resolución espaciotemporal sin alterarlas con demasiada luz.

Un solo volumen cada 15 s, 21 volúmenes en 5 min, volumen captado: 78 µm × 44 µm × 22 µm, 0,3 µm de tamaño de paso, 134 planos por volumen, 20 ms de tiempo de exposición, 30 × 1000 de lámina de luz reticular, dos canales.

En experimentos anteriores con microscopía confocal, el fotoblanqueo y la fototoxicidad planteaban problemas para la recopilación de datos.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 permitió la captura de imágenes volumétricas de las esferas para rastrear las divisiones y los reordenamientos celulares.

Un solo volumen cada 10 min durante 16 h, se grabaron 97 volúmenes, volumen captado: 520 µm × 540 µm × 32 µm, 12 ms de tiempo de exposición, 100 × 1800 de lámina de luz reticular.

Se observa fototoxicidad con estas muestras cuando se utiliza la microscopía confocal tradicional.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 permite adquirir imágenes de las células durante 12 horas con suficiente resolución para captar imágenes de la actina y las mitocondrias individuales, incluso durante eventos mitóticos.

Cinco posiciones, un solo volumen cada 10 minutos durante 12 horas, se grabaron 73 volúmenes, volumen captado: 75 µm × 120 µm × 16 µm por posición, 30 ms de tiempo de exposición, 30 × 1000 de lámina de luz reticular, tres canales.

Con la microscopía confocal convencional hay que hacer concesiones en cuanto a velocidad o resolución para obtener imágenes del organoide cerebral entero en un tiempo razonable.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 capta imágenes del organoide entero con una resolución suficiente para distinguir neuronas individuales en menos de 10 minutos.

Volumen captado: 1,37 mm × 1,18 mm × 76 µm, 5 ms de tiempo de exposición, 100 × 1800 de lámina de luz reticular, dos canales.

La microscopía widefield proporcionaba la velocidad necesaria para la captura de imágenes en vivo de las células endoteliales de los vasos sanguíneos, pero solo con ZEISS Lattice Lightsheet 7 se pudo lograr una mayor resolución, especialmente en la dimensión axial.

Un solo volumen cada 8 s durante 15 min, se grabaron 115 volúmenes, volumen captado: 200 µm × 250 µm × 55 µm, 3 ms de tiempo de exposición, 100 × 1800 de lámina de luz reticular, dos canales.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 permite captar imágenes volumétricas de la dinámica membranaria ultrarrápida con una resolución casi isotrópica para la caracterización detallada de las ondulaciones membranarias.

Un solo volumen cada 1,5 s durante 2 min, se grabaron 85 volúmenes, volumen captado: 58 µm × 60 µm × 9 µm, 3 ms de tiempo de exposición, 15 × 550 de lámina de luz reticular.

La captura de imágenes de neuronas en un C. elegans entero requiere una captura ultrarrápida de grandes volúmenes, lo que resulta difícil para las tecnologías como la microscopía confocal tradicional.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 no solo proporciona la resolución temporal necesaria, sino también la resolución espacial para identificar y seguir neuronas individuales en el gusano en movimiento.

Un solo volumen cada 2 min durante 1 h y 20 min, se grabaron 41 volúmenes, volumen captado: 300 µm × 340 µm × 55 µm, 15 ms de tiempo de exposición, 100 × 1800 de lámina de luz reticular, dos canales.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 capta los linfocitos T en vivo y en acción. La rápida y delicada captura de imágenes volumétricas de las interacciones celulares con una resolución casi isotrópica lo convierte en la herramienta perfecta para estudiar el comportamiento y la función de los linfocitos T.

Tres posiciones, un solo volumen cada 3 min durante 2 h y 15 min, 507 planos por volumen, volumen captado: 300 µm × 130 µm × 16 µm por posición, 25 ms de tiempo de exposición, 30 × 1000 de lámina de luz reticular, dos canales.

Los eventos de señalización de calcio son conocidos por ser eventos ultrarrápidos, y puede resultar difícil capturar el volumen total de un organoide con la suficiente rapidez para no perderse tales eventos.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 permite la captura de imágenes en cámara rápida del organoide entero con una alta resolución temporal para captar los destellos de calcio en cada célula.

Un solo volumen cada 10 s durante 10 min, 376 planos por volumen, volumen captado: 145 µm × 350 µm × 75 µm, 5 ms de tiempo de exposición, 100 × 1800 de lámina de luz reticular.