ZEISS Lattice Lightsheet 7
Captura de imágenes volumétricas a largo plazo de células vivas
ZEISS Lattice Lightsheet 7 facilita la microscopía de fluorescencia basada en hoja de luz para la captura de imágenes de células vivas con resolución subcelular, a la vez que también le permite usar sus portamuestras estándar. Con este sistema automatizado fácil de usar, la captura de imágenes volumétricas de estructuras y dinámicas subcelulares durante horas y días con la mejor protección frente al fotodaño se convierte en algo accesible para todo el mundo. Descubra la dinámica de la vida con un nivel de detalle sin precedentes: con una facilidad que nunca había creído posible.
Descubra la dinámica subcelular de la vida
Tecnología de hoja de luz reticular accesible para todo el mundo
La importancia de la captura de imágenes delicada con hoja de luz a alta resolución para el estudio de procesos subcelulares es inestimable. Con Lattice Lightsheet 7, ZEISS simplifica enormemente los beneficios de esta avanzada tecnología. No tendrá que adaptarse a la preparación habitual de las muestras y podrá examinar especímenes vivos directamente sobre los portamuestras estándar que ya utiliza para la microscopía confocal. En este sistema, los procesos de alineación complejos se realizan automáticamente para que pueda centrar toda su atención en sus experimentos.
Prácticamente sin fototoxicidad ni blanqueamiento
Usted desea observar la dinámica de la vida con resolución subcelular para estudiar cómo cambian con el tiempo las estructuras más pequeñas, pero sus sistemas convencionales de captura de imágenes rápidamente alcanzan sus límites, ya que son demasiado invasivos y destruyen lo que se está observando. En su lugar, ZEISS Lattice Lightsheet 7 proporciona luz estructurada en forma reticular que se adapta automáticamente a sus muestras sensibles, lo que da lugar a una enorme reducción del fotoblanqueo y la fototoxicidad y permite que sus experimentos continúen durante horas e incluso días. El entorno de incubación controlado y un mecanismo de autoinmersión integrado permiten realizar experimentos sin supervisión durante un tiempo prolongado.
Vídeo: Célula LLC-PK1 en proceso de mitosis. Células que expresan H2B-mCherry (cian) y α-tubulina mEGFP (magenta), captadas durante un periodo de 25 horas.
Captura de imágenes volumétricas de alta velocidad
La captura de imágenes extremadamente rápida de ZEISS Lattice Lightsheet 7 permite hasta tres escaneos de volumen por segundo. Gracias a la captura de imágenes dinámicas de todo el volumen de la muestra con esta elevada resolución temporal, no se volverá a perder un evento interesante en su cubreobjetos. La resolución casi isotrópica a lo largo de los ejes X, Y y Z le ofrece una imagen tridimensional de su muestra que revela detalles estructurales con sus proporciones auténticas. El rápido cambio del láser le permite captar imágenes usando hasta tres colores de forma prácticamente simultánea, con mínima diafonía cromática.
Vídeo: Célula COS-7 transfectada de forma pasajera con Tomm20-mEmerald y Calreticulin-tdTomato. El ejemplo muestra cómo el RE envuelve las mitocondrias y ayuda en la fisión mitocondrial.
La tecnología que hay detrás
El principio de la microscopía basada en hoja de luz reticular
Microscopía basada en hoja de luz
También se denomina microscopía basada en hoja de luz gaussiana, y en general es bien conocida por sus condiciones de captura delicada de imágenes con velocidad de captura superior. El innovador concepto de desacoplar la excitación y la detección permite iluminar únicamente la parte de la muestra que está en el plano focal de la lente del objetivo de detección. Al mover la hoja con respecto a la muestra y registrar una imagen por plano focal, puede captar datos volumétricos sin exponer las áreas de la muestra desenfocadas.
Microscopía basada en hoja de luz reticular
Combina las ventajas de la microscopía basada en hoja de luz con una resolución casi isotrópica en el rango confocal. La avanzada tecnología moldeadora del haz crea hojas de luz de forma reticular que son significativamente más finas que las hojas de luz gaussianas estándar y, por tanto, ofrece una mejor resolución a velocidades de captura comparables. La estructura reticular de la hoja de luz se crea usando un modulador de luz espacial (SLM), que después se proyecta sobre la muestra tras pasar por escáneres que difuminan la estructura reticular para crear una hoja de luz lisa.
Implementación de la microscopía basada en hoja de luz reticular de ZEISS
Durante el desarrollo de Lattice Lightsheet 7, ZEISS prestó especial atención a la facilidad de uso y la compatibilidad con técnicas convencionales de preparación de muestras. Una configuración inversa es el requisito previo más importante para permitir el uso de portamuestras estándar para microscopía de alta resolución. Los principales desafíos que plantea una configuración inversa son las disparidades del índice de refracción, ya que la fluorescencia se emite desde la muestra, atraviesa los medios acuosos del cultivo celular, un cubreobjetos inclinado de cristal y la inmersión en agua, y después llega al objetivo de detección.
Óptica ZEISS sin igual
Los elementos ópticos especiales y patentados de ZEISS en la trayectoria del haz de detección compensan las disparidades del índice de refracción y le permiten captar imágenes de las muestras de forma tan fácil y rápida como con un microscopio confocal.
Características del producto
Uso de portamuestras estándar
- Portas
- Placas de 35 mm
- Portas con cámaras
- Placas de múltiples pocillos
Ubicación de la muestra rápida y delicada
Gracias a los LED de transmisión integrados y a la detección oblicua que proporciona un contraste tipo DIC, puede ubicar su muestra fácilmente. Cambie de LED de transmisión blancos a rojos para una iluminación más suave en caso necesario. Y puede optar por incluir iluminación de luz transmitida durante las observaciones a largo plazo.
Nivelado automático de la muestra
La platina única de 5 ejes, diseñada específicamente para este sistema, no solo permite el movimiento a lo largo de los ejes X, Y y Z, sino también la inclinación con la máxima precisión en X e Y, compensando incluso las desviaciones más pequeñas en las dimensiones del portador o la posición de la muestra. El nivelado de su muestra se realiza automáticamente, lo cual le evita tediosos procedimientos manuales.
ZEISS Lattice Lightsheet 7: trayectoria del haz
Alineación automática de todos los elementos ópticos
Para obtener los mejores resultados de captura de imágenes, la hoja de luz reticular se debe adaptar a cada muestra. Por ello, ZEISS ha implementado la alineación automática de todos los elementos ópticos para eliminar los laboriosos ajustes manuales. El innovador diseño de la trayectoria del haz de excitación permite un cambio rápido de las líneas de láser sin tener que reprogramar el SLM. Esto permite la adquisición prácticamente simultánea de conjuntos de datos multicanal para que no se pierda ningún evento que se produzca en su muestra.
Doble resolución temporal con dos cámaras
El innovador diseño de la trayectoria del haz de excitación permite la excitación simultánea de la muestra con múltiples líneas de láser. Combinado con dos cámaras Hamamatsu ORCA-Fusion, permite la captura realmente simultánea de imágenes en dos canales, lo cual es fundamental para una gama de aplicaciones como los experimentos radiométricos. Una configuración de cámara doble también le permite usar filtros de paso de banda individuales delante de cada cámara para minimizar la diafonía y lograr los resultados más limpios sin afectar a la velocidad.
Experimentos sin supervisión a largo plazo
Incubación: Un sistema de incubación integrado proporciona estabilidad a largo plazo en condiciones ambientales variables. El microscopio controla y monitoriza automáticamente la temperatura, los niveles de CO2 y O2, y la humedad para preservar la integridad de la muestra durante los experimentos. La tapa con ventana de cristal permite el acceso rápido y fácil a la muestra para facilitar su inspección durante una serie experimental.
Autoinmersión: Prepare el sistema para liberar aire y, a continuación, se liberará automáticamente una cantidad de medios de inmersión adaptada a las necesidades de sus experimentos. La reposición de los medios de inmersión se controla mediante software, así que no tendrá que preocuparse por interferir en la captura de las imágenes. El depósito está protegido de la iluminación para mantener a raya el crecimiento bacteriano. Los objetivos se protegen frente al suministro de inmersión, por lo que permanecen secos, incluso si se aplica un exceso de medios de inmersión.
Aplicaciones típicas
ZEISS Lattice Lightsheet 7 en funcionamiento
Lamina B1 en acción
La lamina B1 se localiza en el envoltorio nuclear y está implicada en el desensamblaje y la nueva formación de la envoltura nuclear durante la mitosis. La formación de las llamadas «invaginaciones nucleares» se ha notificado con frecuencia para muchos tipos celulares diferentes durante eventos mitóticos en diferentes estadios del ciclo celular. Las invaginaciones nucleares pueden manifestarse como estructuras tubulares que se extienden desde el envoltorio nuclear y cruzan el núcleo. Aunque estas estructuras únicas se han notificado con frecuencia, la mayor parte de la investigación hasta ahora se ha realizado con células fijadas. En consecuencia, la función de estas estructuras es muy desconocida, incluso a pesar de que se han propuesto muchas hipótesis.
Este conjunto de datos se registró con una línea celular del Allen Institute for Cell Science en Seattle: células madre pluripotentes inducidas humanas que expresan de forma endógena lamina B1 marcada con mEGFP (AICS-0013). El experimento nocturno se grabó durante casi 8 horas con un volumen captado cada 1,5 min. Las células sometidas a mitosis se pueden observar durante toda la grabación. La formación y la dinámica de las invaginaciones nucleares se pueden observar con claridad en la mayoría de las células, durante todo el ciclo celular.
Una iluminación suave es fundamental para la captura de imágenes de la mitosis, ya que este proceso es muy delicado y muy sensible a la luz. Para prevenir la replicación del ADN dañado, las células detienen la mitosis en cuanto hay daño por la luz de excitación. Para captar eventos mitóticos durante periodos de tiempo más prolongados, se requiere la delicadeza de la captura de imágenes de Lattice Lightsheet 7 y un sistema extremadamente estable. La captura rápida de imágenes volumétricas en combinación con una resolución casi isotrópica permite mirar la muestra desde cualquier ángulo e investigar estructuras subcelulares únicas en cada detalle. ZEISS Lattice Lightsheet 7 es la herramienta perfecta para experimentos complejos como este. Las aplicaciones que antes eran imposibles ahora se hacen realidad, y gracias a la facilidad de uso, también pueden hacerse realidad para su investigación.
Investigación fiable de colocalización
Si lo que quiere es investigar la colocalización, no puede permitirse nada de diafonía para tener la seguridad de que la colocalización observada es real. Sin embargo, la elección de usar filtros de un solo paso de banda implica que necesita cambiar los filtros durante la captura de imágenes y esto ralentiza la captura lo suficiente como para provocar un cambio significativo entre estructuras que sabe que se deberían superponer. Por tanto, no puede estar seguro de los resultados de colocalización y de las interacciones observadas. Una configuración de cámara doble resuelve este dilema, dándole la confianza en los datos captados y en los resultados que puede extraer de ellos.
Células U2OS teñidas con MitoTracker Green (verde) y MitoTracker Red CMXRos (magenta), dos colorantes que localizan mitocondrias y, por tanto, siempre deben colocalizar. Izquierda: configuración de cámara individual. Un retraso en el tiempo de grabación entre los dos canales se manifiesta como un cambio espacial de las estructuras. Derecha: configuración de cámara doble. Las estructuras se solapan completamente, como era de esperar. Se captaron 60 puntos temporales con una cámara individual, solo se pudieron captar 16 puntos temporales en el mismo tiempo.
Vida en desarrollo en estadios tempranos
Ovocitos
Ovocitos de ratón vivos detenidos en metafase II
Ovocitos de ratón vivos detenidos en metafase II y teñidos para mitocondrias (cian), microtúbulos (magenta) y cromosomas (amarillo). Muestra: cortesía de C. So, MPI Göttingen, Alemania.
Vida en desarrollo de pequeños organismos en evolución
Pez cebra, C.elegans, Drosophila
Embrión de pez cebra: tráfico de moléculas de ARNm
Se hizo un seguimiento del tráfico de moléculas de ARNm en arivis Vision4D®. Primero se corrigió el movimiento del embrión de pez cebra usando una pista de referencia del núcleo. Se hizo un seguimiento de las moléculas individuales de ARNm con el tiempo para dar estadísticas como la velocidad y la direccionalidad. Muestra: cortesía del Prof. Andrew Oates, EPFL, Suiza.
Desarrollo de modelos celulares en 3D
Los esferoides y organoides son modelos in vitro de órganos, mucho más pequeños y simples, pero fáciles de producir y, por tanto, son una herramienta muy valiosa para que los biólogos del desarrollo puedan estudiar el desarrollo de órganos. A diferencia de los cultivos celulares, que normalmente solo constan de una monocapa de células, las células en esferoides/organoides forman estructuras tridimensionales que permiten la investigación de la migración celular y la diferenciación dentro de los modelos celulares en 3D. Con la microscopía basada en hoja de luz reticular, la captura de imágenes del desarrollo y la autoorganización de los organoides se hace realidad. Aquí podemos ver un renderizado en 3D de un esferoide compuesto por células que expresan H2B-mCherry (cian) y α-tubulina-mEGFP (magenta). No todas las células están marcadas.