Molecular Quantification Toolkit

Los experimentos de fotoblanqueamiento y de fotoactivación requieren una definición precisa de los compartimentos celulares para orgánulos o condensados que deben ser manipulados. ZEN Molecular Quantification Toolkit le permite configurar de forma sencilla regiones de interés, ya sea mediante un análisis manual o automatizado, y separarlas en regiones de blanqueamiento o control. Gracias a la tecnología láser del sistema confocal, se pueden abordar estas regiones píxel a píxel con la longitud de onda e intensidad más eficientes.

Los experimentos de dinámica molecular implican análisis sofisticados que requieren la integración de regiones o imágenes de referencia o el ajuste de la curva exponencial. El kit de herramientas ofrece análisis guiados para aplicaciones de fotomanipulación como constantes de difusión de cinética de primer o segundo orden en FRAP, todos los métodos habituales para el cálculo de eficiencia de FRET y un análisis ratiométrico flexible. Además, ofrece opciones atractivas para visualizar los resultados.

El método de la recuperación de la fluorescencia posterior al fotoblanqueamiento (FRAP) sirve para investigar la movilidad de una molécula fluorescente. Los fluoróforos se desactivan de forma irreversible en una pequeña región. La frecuencia con la cual las moléculas fluorescentes próximas interactúan con esta región permite determinar la frecuencia de difusión y la cantidad de moléculas ligadas o libres.

A parte de la FRAP estándar, existen varios métodos relacionados. La FRAP inversa (iFRAP) y la «Pérdida de la fluorescencia en fotoblanqueamiento» (FLIP) ayudan a determinar si una región (p. ej., un orgánulo) está interactuando activamente con su entorno o está aislada. La «localización de la fluorescencia posterior al fotoblanqueamiento» (FLAP) permite la definición espacial precisa de las moléculas diana. El kit de herramientas admite todos estos métodos.

Para las mediciones, la FRET utiliza los principios físicos de la transferencia de Förster, una transferencia de energía entre dos fluoróforos coincidentes que se encuentran muy cerca (<10 nm). Este método revela detalles precisos de la asociación o disociación dinámicas de proteínas.

El kit de herramientas tiene flujos de trabajo concretos para los dos métodos principales de FRET. El primero es el fotoblanqueamiento del aceptador, en el cual se blanquea la región de interés en el canal del aceptador. Esto hace que se desactive el aceptador e impide cualquier transferencia de energía de Förster del donante.