La microscopie à feuillet de lumière en treillis pour la recherche en sciences de la vie

Pendant la transition de l'épiblaste naïf à un état pluripotent, plus de 100 cellules sont organisées en un embryon de souris préimplantatoire d'un diamètre d'environ 60-80 µm. Pour examiner les changements dans l'expression des gènes au cours de cette transition, des échantillons vivants et fixés sont imagés à différents moments à l'aide d'un microscope confocal à disque rotatif. L'analyse volumétrique des profils d'expression cellulaire apporte la preuve de l'existence de mécanismes moléculaires régulant le développement des embryons de souris préimplantatoires.

Pour déterminer quelles cellules expriment des marqueurs cellulaires spécifiques et comment elles sont organisées les unes par rapport aux autres, une imagerie volumétrique des embryons préimplantatoires par microscopie confocale est nécessaire. À ce stade, les embryons sont sensibles aux changements de l'environnement de croissance, à l'intégrité structurelle et à la phototoxicité. Pour éviter tout changement aberrant dans le phénotype de développement, les embryons ne peuvent pas être pressés contre la vitre de couverture et doivent être imagés rapidement et avec une faible phototoxicité. La seule option disponible est donc, dans ce cas, d'utiliser la microscopie confocale à disque rotatif. En effet, cette méthode d'imagerie répond à la nécessité d'une faible phototoxicité et permet presque d'atteindre la vitesse requise. Toutefois, elle souffre d'une perte spectaculaire de l'intensité du signal lorsque la profondeur d'imagerie augmente dans les embryons. Par conséquent, il n'est généralement pas possible d'imager plus de la moitié de la profondeur des échantillons.

Le microscope ZEISS Lattice Lightsheet 7 a permis d'imager toute la profondeur des embryons, sans ou avec peu de phototoxicité, à la vitesse requise pour éviter les artefacts de mouvement et avec une perte minimale de l'intensité du signal. En outre, l'imagerie volumétrique des embryons avec ZEISS Lattice Lightsheet 7 a permis une résolution quasi isotrope pour une représentation plus précise de l'organisation cellulaire au sein de l'embryon. Cette technologie d'imagerie nous permettra de mesurer les signatures d'expression génique au cours de cette étape cruciale du développement embryonnaire.

Volume d'acquisition : 230 µm x 124 µm x 94 µm, temps d'exposition de 30 ms, 30 x 1000 feuillets de lumière en treillis, deux canaux.

La microscopie confocale conventionnelle ne peut pas imager l'ensemble du modèle cellulaire 3D avec une résolution temporelle supérieure à la fréquence de battement.

La capacité du ZEISS Lattice Lightsheet 7 à réaliser une imagerie volumétrique rapide avec une résolution subcellulaire peut être utilisée pour étudier les variations tissulaires, entre autres la contractilité et la viabilité cellulaires.

Un volume toutes les 1,26 sec, 48 vol/min pendant 1 min, volume imagé : 300 µm x 435 µm x 125 µm, incrément de 2 µm, 126 plans par volume, temps d'exposition de 1 ms, 100 x 1800 feuillets de lumière en treillis.

Les cellules sont cultivées sur un polymère cyclo-oléfine (COP) avec une structure en grille afin d'observer la progression des cônes de croissance le long de la grille. Les cônes de croissance sont extrêmement sensibles à la lumière et commencent à rétrécir en cas de surexposition à la lumière d'excitation. En outre, la structure en grille du COP pose de nombreux défis aux systèmes d'imagerie traditionnels. Des artefacts de double image peuvent être observés lors de l'utilisation d'un confocal à balayage laser traditionnel. Le COP a également un indice de réfraction de 1,53, alors que le verre a un indice de réfraction de 1,52, et l'épaisseur du fond du COP est de 200 µm ; ces paramètres peuvent entraîner un flou sur l'image.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 est capable de relever ces défis. En orientant la structure de la grille parallèlement au feuillet de lumière en treillis et en ajustant l'optique de forme libre spécifique à Lattice Lightsheet 7, la double image peut être supprimée. En outre, les manipulations douces que permet ZEISS Lattice Lightsheet 7 en font l'outil idéal pour étudier le mouvement dynamique des neurones en développement en 4D avec une haute résolution spatio-temporelle sans les perturber avec trop de lumière.

Un volume toutes les 15 sec, 21 volumes en 5 min, volume imagé : 78 µm x 44 µm x 22 µm, incrément de 0,3 µm, 134 plans par volume, temps d'exposition de 20 ms, 30 x 1000 feuillets de lumière en treillis, deux canaux.

Lors d'expériences précédentes utilisant la microscopie confocale, des problèmes de photoblanchiment et de phototoxicité ont entravé la collecte des données.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 a permis l'imagerie volumique des sphères afin de suivre les divisions et les réarrangements cellulaires.

Un volume toutes les 10 min pendant 16 h, 97 volumes ont été enregistrés, volume imagé : 520 µm x 540 µm x 32 µm, temps d'exposition de 12 ms, 100 x 1800 feuillets de lumière en treillis.

La phototoxicité est observée avec ces échantillons lors de l'utilisation de la microscopie confocale traditionnelle.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 permet d'imager des cellules pendant 12 heures avec une résolution suffisante pour visualiser l'actine et les mitochondries individuelles, même pendant les événements mitotiques.

Cinq positions, un volume toutes les 10 min pendant 12 h, 73 volumes ont été enregistrés, volume imagé : 75 µm x 120 µm x 16 µm par position, temps d'exposition de 30 ms, 30 x 1000 feuillets de lumière en treillis, trois canaux.

La microscopie confocale conventionnelle exige un compromis sur la vitesse ou la résolution afin d'obtenir une image de l'ensemble de l'organoïde cérébral en un temps raisonnable.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 a besoin de moins de 10 minutes pour prendre des images de l'ensemble de l'organoïde avec une résolution suffisante pour distinguer les neurones individuels.

Volume d'acquisition : 1,37 mm x 1,18 mm x 76 µm, temps d'exposition de 5 ms, 100 x 1800 feuillets de lumière en treillis, deux canaux.

La microscopie à champ large a fourni la vitesse requise pour l'imagerie en direct des cellules endothéliales des vaisseaux sanguins, mais ce n'est qu'avec ZEISS Lattice Lightsheet 7 qu'une résolution plus élevée, en particulier dans la dimension axiale, a pu être obtenue.

Un volume toutes les 8 sec pendant 15 min, 115 volumes ont été enregistrés, volume imagé : 200 µm x 250 µm x 55 µm, temps d'exposition de 3 ms, 100 x 1800 feuillets de lumière en treillis, deux canaux.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 permet l'imagerie volumétrique de la dynamique membranaire ultrarapide avec une résolution quasi-isotropique pour une caractérisation détaillée des remous membranaires.

Un volume toutes les 1,5 sec. pendant 2 min, 85 volumes ont été enregistrés, volume imagé : 58 µm x 60 µm x 9 µm, temps d'exposition de 3 ms, 15 x 550 feuillets de lumière en treillis.

Imager les neurones d'un C. elegans entier requiert une imagerie ultrarapide de grands volumes, ce qui pose problème avec des technologies telles que la microscopie confocale traditionnelle.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 fournit non seulement la résolution temporelle requise, mais aussi la résolution spatiale pour identifier et suivre les neurones individuels dans le ver en mouvement.

Un volume toutes les 2 min pendant 1 h 20 min, 41 volumes ont été enregistrés, volume imagé : 300 µm x 340 µm x 55 µm, temps d'exposition de 15 ms, 100 x 1800 feuillets de lumière en treillis, deux canaux.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 capture les cellules T en direct et en action. L'imagerie volumétrique rapide et douce des interactions cellulaires avec une résolution quasi-isotropique en fait l'outil idéal pour étudier le comportement et la fonction des cellules T.

Trois positions, un volume toutes les 3 min pendant 2 h 15 min, 507 plans par volume, volume imagé : 300 µm x 130 µm x 16 µm, temps d'exposition de 25 ms, 30 x 1000 feuillets de lumière en treillis, deux canaux.

Les événements de signalisation calcique sont connus pour être ultrarapides et capturer le volume complet d'un organoïde assez rapidement : ne pas manquer de tels événements peut relever du défi.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 permet l'imagerie en temps réel de l'ensemble de l'organoïde avec une haute résolution temporelle pour capturer les flashs de calcium des cellules individuelles.

Un volume toutes les 10 sec pendant 10 min, 376 plans par volume, volume imagé : 145 µm x 350 µm x 75 µm, temps d'exposition de 5 ms, 100 x 1800 feuillets de lumière en treillis.