ZEISS Correlative Cryo Workflow

La perte d'échantillons, la contamination par la glace et la dévitrification sont des problèmes bien connus en cryo-microscopie. ZEISS Correlative Cryo Workflow est conçu pour protéger vos précieux échantillons vitrifiés afin qu'ils ne soient pas endommagés au cours de ce protocole exigeant.

Le kit d'accessoires ZEISS Cryo et les capacités d'imagerie du microscope à balayage laser ZEISS/Airyscan et de ZEISS Crossbeam réduisent le risque de perte ou de destruction de votre échantillon lorsque vous travaillez dans des conditions cryogéniques.

Avant même de gérer votre échantillon dans le processus, la vitrification est déjà un défi en soi. En effet, malgré le développement récent des technologies de vitrification, les échantillons sont encore souvent recouverts d'une épaisse couche de glace. Ils peuvent s'avérer aussi seulement partiellement vitrifiés et présenter des zones de glace non amorphe. Une mauvaise vitrification détruit l'ultrastructure des cellules et des tissus. Ces zones ne peuvent être identifiées que dans un TEM, sauf si votre microscope optique ou le FIB-SEM fournit des méthodes d'évaluation des échantillons au début du processus.

Les microscopes à balayage laser ZEISS offrent cette capacité d'évaluation en permettant différentes méthodes de contraste. L'excellente performance de contraste du ZEISS Crossbeam évalue par ailleurs fiablement la qualité de l'échantillon : vous gagnez du temps et améliorez le rendement de vos expériences.

La mesure de l'épaisseur de la glace est cruciale pour juger de la qualité des échantillons et localiser les cellules d'intérêt dans le spécimen vitrifié. Grâce au microscope optique, votre échantillon est validé facilement. La lumière réfléchie et l'imagerie confocale en fluorescence donnent les premiers indices sur la qualité et favorisent une localisation claire des cellules prometteuses.

Les motifs flous en toile d'araignée du signal fluorescent indiquent souvent une congélation défectueuse. En outre, les échantillons congelés en plongée présentent une qualité de congélation et une conservation inégales dans un même échantillon. Les informations sur l'épaisseur et la qualité de la glace permettent de présélectionner rapidement les cellules avant de passer à l'étape suivante dans le processus cryogénique corrélatif.

Une fois les structures cellulaires, tels les corps polaires du fuseau, identifiées dans le système du microscope à balayage laser, la qualité d'imagerie supérieure de ZEISS Crossbeam cible et analyse l'ultrastructure à l'aide de l'imagerie volumique cryogénique. Même avec de faibles tensions d'accélération, Crossbeam livre une imagerie à fort contraste des échantillons vitrifiés et non colorés en protégeant l'échantillon contre les risques de dégradation. L'acquisition haute résolution avec le microscope à balayage laser et les images à fort contraste du Crossbeam permettent une superposition simple et précise des images. Lorsque la région d'intérêt est relocalisée dans Crossbeam à l'aide de ZEN Connect, l'acquisition d'ensembles de données en 3D des cellules identifiées est terminée. Deux corps polaires du fuseau ont été ciblés dans le volume corrélatif. L'orientation des microtubules individuels devient clairement visible sur les images à fort contraste, selon la direction de coupe du FIB. D'autres compartiments cellulaires ont pu être identifiés dans le volume en 3D.

_{Échantillon avec l'aimable autorisation de M. Pilhofer, ETH, Zurich, Suisse}

La réponse des plantes face aux changements environnementaux, comme l'augmentation de la salinité, est un sujet de recherche important en biologie végétale. Les plantes présentent souvent des réactions de stress face à ces conditions changeantes. L'un des effets observables au niveau de l'ultrastructure est la formation de stromules, de longues extensions tubulaires dans les plastides.

Le projet ZEN Connect montre des images issues de différentes modalités d'imagerie : le microscope à balayage laser a été utilisé pour localiser les stomates et les plastides internalisés à l'aide de l'autofluorescence de l'échantillon. Après une relocalisation réussie de la région d'intérêt, l'image du microscope à balayage laser a été superposée à une image d'ensemble MEB de la stomie sélectionnée. Une pile d'images FIB de la stomie a été acquise. L'ensemble de données EM a révélé une augmentation de la formation de stromules dans les plastides.

_{Avec l'aimable autorisation de : B. Franzisky, Université d'Hohenheim, Allemagne}