ZEISS Correlative Cryo Workflow

試料ロス、アイスコンタミネーション、失透は、クライオ顕微鏡法においてよく起きるトラブルです。ZEISS Correlative Cryo Workflowは、複雑な装置において、貴重なガラス化試料を様々な落とし穴から守るために設計されています。

ZEISS Cryo AccessoryキットおよびZEISS LSM/AiryscanとZEISS Crossbeamの優れたイメージング機能は、試料のロスや破損のリスクを軽減します。

また、クライオ顕微鏡における試料の失透は、それ自体が困難な問題です。近年のガラス化技術の進歩にもかかわらず、ガラス化試料の氷層の厚さの制御や不十分なガラス化の抑制は大きな課題です。ガラス化が不完全だと、細胞と組織の超微細構造が破壊されてしまいます。ワークフローの初期段階に光学顕微鏡やFIB-SEMによる評価ステップが無いと、このような不適切な試料にTEM観察で初めて気づくことになります。

ZEISS LSMでは、様々なコントラスト法を用いてクライオ試料内部のガラス化状態が確認できます。さらに、ZEISS Crossbeamの優れたコントラスト性能によって、クライオ試料の品質評価が可能になります。これにより時間を節約し、実験効率を高めることができます。

氷膜厚の厚さ測定は、試料の品質判断やガラス化試料内部の観察対象の位置特定に極めて重要です。光学顕微鏡によって、試料の妥当性を容易に評価することができます。反射光と共焦点蛍光イメージングによって、試料品質に関する最初の情報が得られ、観察対象の位置を明確に確認することが可能です。

蛍光シグナルのクモの巣状のパターンは、凍結不良を簡単に検出できます。さらにプランジ凍結試料は、一個の試料内にも場所によって凍結品質や保存状態が異なります。蛍光顕微鏡データにより氷層の厚さと試料品質に関する情報を得ることで、相関クライオ顕微鏡ワークフローにおいて次のステップに移行する前に、細胞を選択する時間が節約できます。

LSMシステムにおいて紡錘体極体のような細胞構造を識別した後、ZEISS Crossbeamの優れたイメージングによって、狙った細胞の超微細構造のクライオボリュームイメージングが可能になります。Crossbeamの優れた低加速度電圧イメージング性能により、無染色のガラス化試料でも試料損傷を抑制しながら高コントラストのイメージングができます。LSMで取得した高解像度像とCrossbeamによる高コントラスト画像によって、画像のオーバーレイが容易に実現します。ZEN Connectを使用してCrossbeamで関心領域を決めると、識別された細胞の3Dデータが取得されます。2つの紡錘体極体が相関ボリューム内でターゲットになっています。この例では、個々の微小管がFIBの切断方向に沿って高コントラストの画像で明瞭に観察できます。細胞内の他の構造体も3Dイメージングで確認できます。

_{試料ご提供：M. Pilhofer, ETH Zürich, Switzerland}

塩分濃度の上昇などの環境条件の変化に対する植物の反応は、植物科学において重要な研究課題です。一般的に、植物は環境条件変化にストレス反応を示します。これを調べるために、微細構造レベルではストロミュール（色素体から延びる管状の構造）の形成を観察するというような手法があります。

ZEN Connectプロジェクトは、様々なイメージングモダリティの画像を表示しています。まず、試料の自家蛍光を利用して、LSMで気孔と内在色素体の位置を同定しました。その後、FIB-SEMで関心領域の位置を特定し、選択した気孔のSEMオーバービュー画像を用いて、LSM画像をオーバーレイ表示しました。そして、気孔のFIBスタック画像を取得しました。EMデータセットによって、色素体でストロミュールの形成が増大していることが明らかになりました。

_{試料ご提供：B. Franzisky, University of Hohenheim, Germany}