
ZEISS LSM 990 Spectral Multiplex
空間生物学を深く理解するためのマルチ蛍光イメージング
LSM 990 Spectral Multiplexは、蛍光標識のスペクトル分離に優れています。多数のタンパク質マーカーと蛍光シグナルの明確な分離により、自家蛍光を確実に除去しながら高度なスペクトルマルチプレックス実験を最適化します。最適なイメージング条件、迅速な色素の識別、取得から解析までの合理化されたワークフローを促進するシステムの利用により、生産性が向上します。
効率的なスペクトルマルチプレックス
すべてのスペクトル情報を1回の画像スキャンで取得します
LSM 990 Spectral Multiplexは、 380~900 nmの波長域をカバーし、要求の厳しいスペクトルイメージング実験に対して比類ない生産性を提供します。インテリジェントな設計によるビームパスの選択により、スペクトル分離、感度、速度、S/N比、解像度における妥協はありません。スペクトル情報を取得するLambdaスキャンにより、 10種類以上の個別ラベルを同時に分離できます。すべてのスペクトルを1回のスキャンで取得することで、即座に分離し、リアルタイムで結果のチャンネルを表示できます。これにより、短時間で多数のラベルを識別すると同時に、空間分解能の向上が求められる場合や、大量の試料や生体試料のイメージングに役立ちます。ターゲットのタンパク質の真のシグナルをロスすることなく、自家蛍光など不要なシグナルを簡単に除くことができます。すべてのLambda情報は保持され、スペクトルは見やすいグラフで表示されるため、期待通りの蛍光ラベルをイメージングできているかどうかを評価するのに役立ちます。
13色の蛍光と自家蛍光を一度に取得

左:スペクトル画像(Lambdaスタック):13種類のラベルを同時取得し、実際の色を再現した表示。右: 自家蛍光を除去し、13種類のラベルを分離した画像(LSM Plus処理済み)。
試料提供:Michal Skruzny, ZEISS Microscopy GmbH

分離された単一ラベルおよび自家蛍光。

13種類のスペクトルと自家蛍光スペクトルは、スペクトル分離と正確なスペクトル情報の取得を可能にするために、4種類の色素でラベルした試料を用いて確認されました。上:5本のレーザーラインと励起スペクトル 下:蛍光スペクトル。

ZEISS LSM 990 Spectral Multiplex
空間生物学を深く理解するためのマルチ蛍光イメージング
ユーザーフレンドリーな実験デザイン
スペクトルイメージングを簡単にカスタマイズします。
マルチカラー実験を開始すると、 Smart Setupは幅広い蛍光色素の励起および蛍光データを提供します。最適なスペクトル分離、最大速度、またはバランスの取れた設定オプションから選択し、ワンクリックでシステム全体を要件に合わせて調整できます。また、Lambda Scanモードを選択することで、希望するスペクトル領域内のすべての関連シグナルを1回のスキャンで取得できます。ZENでは、すべての実験設定を保存し、簡単にアクセスできるため、個別の実験設定を迅速に再利用できます。さらに、LSM Plus機能を統合することで、撮影スピードを落とすことなく、 最適なS/N比と空間分解能の向上を実現できます。
シロイヌナズナ(Arabidopsis)におけるGFPとRFPの自家蛍光からの容易な分離

GFP-HDEL(小胞体)およびST-mRFP(ゴルジ体)を発現するシロイヌナズナの葉。32のスペクトルチャンネルを同時取得したLambdaスタックで、各ピクセルのスペクトル色情報を明確に可視化。
試料ご提供:Verena Kriechbaumer, Oxford Brookes University, UK

411~740 nmのLambdaスタックの単一チャンネル画像。

左:Lambdaスタックから抽出したGFP(緑)、mRFP(ピンク)、およびクロロフィル自家蛍光(白)のスペクトル。画像取得中でも異なるラベルと自家蛍光を容易に識別・分離可能。右:自家蛍光を除去し、LSM Plusによる処理を施した画像(緑:GFP/小胞体、ピンク:mRFP/ゴルジ体、白:クロロフィル)。
リアルタイムのスペクトルアンミキシング
蛍光ラベルを迅速かつ正確に分離します
複数のチャンネルをイメージングする際やLambdaモードを利用する場合、 スペクトルアンミキシングのオプションは常に利用可能です。以前に保存されたスペクトルはローカルデータベースから取得でき、これらの情報とともに、すべてのイメージング設定が保存され、表示されます。新たに取得した画像からスペクトル情報を含むピクセルを手動で選択するか、内蔵の自動コンポーネント抽出機能を利用してそのようなピクセルを識別できます。これらの情報源は、 リニアアンミキシング処理で組み合わせることができます。得られた各マルチチャンネル画像は、クオリティコントロールすることができ、オプションで「残差」チャンネルを元のデータと併せて保存することで、実験の記録をシームレスに管理できます。オンラインフィンガープリンティングを使用することで、1回のスキャンでスペクトル情報を取得し、その場でリニアアンミキシングを実行して即座に分離したシグナルを得ることができます。これは、大量の試料や特定の蛍光ラベルの組み合わせをスクリーニングする際に最適です。
ブタ腎上皮細胞の5色ライブセルオンラインフィンガープリンティング
Tubulin-mEmerald(チューブリン、シアン)およびH2B-mCherry(ヒストン結合DNA、白)を発現するLLC-PK1細胞(ブタ上皮腎細胞株)、さらにMitotracker Orange(ミトコンドリア、黄色)、SiR-Actin(アクチン、ピンク)およびDOPE-ATTO 740(小胞、オレンジ)でラベル付け。LSM Plusでオンラインフィンガープリンティングを使用し、リアルタイムで5色を同時に自家蛍光を除いて撮像したライブセルイメージング(タイムラプス)
イメージングを超えるワークフローの自動化
多角的な実験を効率化して、生産性を向上させます
すべての利用可能なスペクトルデータ取得方法(Lambdaスキャン、リニアアンミキシング、SNR向上のためのLSM Plusなど)を組み合わせ、多次元実験のすべてのステップを実行する単一の処理パイプラインに統合します。複数回の染色およびイメージングを伴う スペクトルマルチプレックス実験の自動ワークフローは、 イマージョン自動供給システムにより簡素化されます。個別の染色、イメージング、ブリーチング、ストリッピングの各ラウンドは、ZEN内で管理できます。1 得られたデータをZEISS arivis proに転送し、スペクトル多重化データの3D統合、AIによるオブジェクトのセグメンテーション、または細胞近傍解析や特徴抽出などの統計解析を行います。
マウス脳切片
試料検出から画像データ処理までのスペクトルマルチプレックスワークフロー
固定マウス脳、厚さ40 µmの切片。DAPI(核)、MAP2-A488(樹状突起および神経細胞体)、Parvalbumin-A568(抑制性/GABA作動性介在ニューロンのサブタイプ)、Iba1-A647(ミクログリア、脳内の常在免疫細胞)、VGAT-750(抑制性/GABA作動性介在ニューロンのシナプス前終末)。
全体像はZEISS AI Sample Finderを使用して取得し、10x対物レンズ、Axiocam 705、LED照明を用いて切片全体を追加。詳細なスキャンはPlan-Apochromat 63x/1.4 Oil 対物レンズを使用して取得。Lambdaスキャンは405、488、561、639、730 nmの励起光を用い、411~900 nmのスペクトル範囲をカバーする35の検出器で設定。5種類のラベルのスペクトルに加え、単染色サンプルから取得した組織の自家蛍光スペクトルを基に画像を分離。画像はLSM Plusを用いて処理。
試料ご提供:Luisa Cortes, Microscopy Imaging Center of Coimbra, CNC, University of Coimbra, Portugal
ZEISS LSM 990
マルチモーダルイメージングの追加オプションマルチスペクトル顕微鏡:テクノロジーインサイト
同時により多くのタンパク質を解析する:光効率に最適化されたシステム
低ダメージなマルチカラーイメージングを最適化するには、イメージングシステムのすべてのコンポーネントが調和して動作し、蛍光の透過を最大限に高めることが重要です。LSM 990 Spectral Multiplexは、貴重なシグナルを効率良く取得するために、従来のマルチカラーイメージングを超える検出器構成とビームパス設計を備えています。
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マルチカラーの同時取得イメージングに柔軟性が求められる場合でも、精密な多色分離イメージングを行う場合でも、低反射角メインビームスプリッター(MBS)でレーザー励起光と蛍光シグナルを確実に分離することから始まります。これによって、蛍光シグナルをロスすることなく最大限に活用することができます。
ZEISS LSM 990のレーザーモジュールは、405~730 nmの広範な励起波長に対応できるように設計されており、さらに、多光子励起レーザー用のオプションとして、2つの独立した波長調整モジュールと追加のコリメーション光学系が用意されています。蛍光のビームパスのすべての光学素子は、380~900 nmの蛍光スペクトル領域の光を最適に透過できるように設計されており、摩耗のない固体ヒンジで制御されるアポクロマートピンホールを通してシグナルを導きます。
ホログラフィックグレーティングにより、すべての蛍光シグナルのリニアスペクトル分離が確実に行われます。これは、検出器の32チャンネルすべてが同じスペクトル幅を捉えることを保証し、効果的なスペクトルアンミキシングと正確な蛍光検出範囲を定義するために10 nmのスペクトル分解能を得るうえで、非常に重要です。
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ZEISS LSM 990検出器の一般的なスペクトル量子効率(QE)
ZEISS LSM 990検出器の一般的なスペクトル量子効率(QE)
LSM 990 Spectral Multiplexの特徴は、32チャンネルのGaAsP検出器を搭載し、さらに2つのサイド検出器とオプションでNIR GaAsおよびGaAsP検出器を2つ追加することができることです。この独自の構成により、LSMシステム中で最大の検出器数を誇ります。
検出器は、スキャンヘッドの設計内で戦略的に配置され、量子効率を最大化し、関連する蛍光波長における光を最適な電子シグナルに変換します。各検出器はリニアで、定量的なデータが保証されます。すべての検出器は相互にキャリブレーションされ、スペクトルシグナルがスペクトルデータベースと一致する方法で表示されます。この機能により、蛍光色素のスペクトルの識別やデータの検証が容易になります。
光子の捕獲を強化するために、LSM 990にはホログラフィックグレーティングで発生する光損失に対処するリサイクリングループが組み込まれています。物理的な原理を活用し、スペクトル分離されなかった光はグレーティングからわずかに異なる角度で出て、リサイクリングループに入ります。そこで偏光が変化し、再びグレーティング上に導かれます。この過程を経ることで、光は再度検出器に向かってグレーティングから出る機会を得ることができます。
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すべての蛍光シグナルが検出器で捉えられると、取得したマルチカラー画像はさらにスペクトル分離が可能です。マルチチャンネルおよびLambda画像も同様に処理され、スペクトルアンミキシングには常に堅牢な処理オプションが利用されます。アンミキシング用のスペクトル情報は、現在の画像から手動で選択することも、ソフトウェアサポート(ACE)を使用して自動的に抽出することもできます。また、そのスペクトル情報はすでにスペクトルデータベースに保存されている場合もあります。すべてのスペクトルは、参照用にデータベースに保存でき、選択した名前、実験設定、スペクトルプレビューによって整理された状態を維持できます。
スペクトル分離には、精緻なリニアアンミキシングアルゴリズムが採用されており、ショットノイズなどの光の特性を考慮した重み付けアンミキシングオプションを組み込むことも可能です。重要なのは、残差チャネルが、すべてのリニアアンミキシング処理におけるシンプルなクオリティコントロールオプションとして機能する点です。明確なスペクトルデータの表示、高度なリニアアンミキシングオプション、残差チャネルを活用することで、スペクトル実験が基準を満たしていることを確認できます。
実験工程を合理化し、すべてのスペクトルアンミキシングをオンラインフィンガープリントを使用して、ライブ実行できます。すべての分離された画像が直接提供されることにより、処理時間とデータ量が削減されます。特に、Zスタック、タイムラプス、多点の組み合わせなどの多次元実験では、スループットを向上させるために、Direct Processingで作成された処理パイプラインにリニアアンミキシングを追加し、LSM Plusと直接組み合わせることで、空間分解能を向上させ、すべての画像のS/N比を向上できます。